MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE, DE LA RECHERCHE

ET DE LA TECHNOLOGIE

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE

présenté par

Fabienne Justy

pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

EVOLUTION DES RELATIONS PLANTES INSECTES ET MECANISMES DE SPECIATION LIES AU CHOIX D’HÔTE

Soutenu le 20 Décembre 2006 devant le jury suivant 

Mongelard Claudine Maître de Conférences EPHE Président/Rapporteur

Veuille Michel Directeur d’études EPHE Examinateur

Olivieri Isabelle Professeur, Université de Montpellier 2 Examinateur

David Patrice Chargé de Recherche CNRS Examinateur

Laboratoire de Biologie intégrative des populations Directeur : M. Veuille

EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) veuille@mnhn.fr

Laboratoire de génétique et Environnement Directeur : I. Olivieri

CNRS, UMR 5554 Université Montpellier 2 olivieri@isem.univ-montp2.fr

Ecole Pratique des Hautes Etudes

Sciences de la Vie et de Terre

EVOLUTION DES RELATIONS PLANTES INSECTES ET MECANISMES DE SPECIATION LIES AU CHOIX D’HÔTE

Fabienne Justy

RESUME

Cette étude porte sur les interactions entre le charançon Larinus cynarae et ses plantes hôtes les chardons du genre Onopordum et Cynara en Sardaigne. Alors que la plupart des charançons du genre Larinus sont des espèces spécialistes, en Sardaigne L. cynarae exploite les deux espèces de plantes hôtes présentes. Cette situation originale permet l’étude de l’évolution de populations de L. cynarae, dont les différences de choix de plante hôte pourraient mener à un isolement reproducteur. L’étude des taux d’attaque en populations naturelles couplée à des expériences de choix en conditions contrôlées a montré qu’il existe bien des différences de comportements entre les charançons des différentes populations. De façon générale les charançons étudiés préfèrent Cynara à Onopordum. Nous avons également développé des marqueurs microsatellites sur Larinus cynarae puis comparé la structure génétique des locus enzymatiques à celle des microsatellites. Ceux-ci se sont avérés informatifs mais les résultats obtenus ont révélé la présence de déficit en hétérozygote s'expliquant en grande partie par la présence d’allèles nuls. L’étude de la structure génétique des populations de L. cynarae à l’aide des deux types de marqueurs suggére que les populations de charançons à l’intérieur de la Sardaigne sont peu différenciées. Cependant nous avons révélé la réduction des échanges de gènes entre populations proches de charançons qui exploitent des espèces d’hôtes différents. Ces populations de Larinus cynarae semblent évoluer vers un choix plus prononcé pour leur plante hôte et de fait s’isolent génétiquement sous l’effet de leur choix contrasté.

Mots clés: Larinus cynarae, Onopordum illyricum, Cynara cardunculus, spéciation sympatrique, allozymes, microsatellites, structure génétique, choix d'hôtes.

Sommaire

INTRODUCTION 4

CHAPITRE 1. MATERIEL BIOLOGIQUE 7

1.1- Biologie de Larinus cynarae et de ses plantes hôtes 7

1.1.1. Cycle biologique 8

1.1.2. Distribution géographique des charançons et des chardons 8

1.2- Echantillonnage 9

CHAPITRE 2. METHODES 10

2.1- Marqueurs moléculaires utilisés : allozymes et microsatellites 10

2.2- Allozymes 10

2.2.1. Définition et propriétés 10

2.2.2. Analyses électrophorétiques  10

2.3- Marqueurs microsatellites 11

2.3.1. Définition et propriétés 11

2.4- Recherche de marqueurs microsatellites chez Larinus cynarae 12

2.4.1. Extraction de l’ADN total 12

2.4.2. Recherche de microsatellites à partir d'une banque génomique classique 12

2.4.3. Recherche de microsatellites à partir d'une banque génomique enrichie en motifs microsatellites  13

a. Principe 13

b. Caractérisation des locus microsatellites 13

c. Polymorphisme observé 13

d. Génotypage des individus 14

2.5- Taux d’attaque dans les populations naturelles 14

2.6- Expériences de choix sur des charançons non naïfs 15

2.7- Méthodes d'analyse 15

CHAPITRE 3. RESULTATS 18

3.1- Structure génétique des populations… 18

3.1.1. Hétérozygotie des marqueurs microsatellites et allozymes 18

3.1.2. Déséquilibre de liaison  18

3.1.3. Equilibre de Hardy Weinberg 19

a. Différenciation entre populations 20

b. Isolement par la distance 21

c. Distances génétiques  25

3.2- Taux d’attaques en populations naturelles 25

3.3- Expériences de choix 26

CHAPITRE 4. PROBLEMES DE DEFICITS EN HETEROZYGOTES

RENCONTRES 29

4.1- Compétition entre allèles  29

4.2- Allèles nuls  30

4.3- Régime de reproduction consanguin 30

4.4- Problèmes liés à l’échantillonnage : l’effet Wahlund 31

4.5- Hérédité des marqueurs microsatellites 31

4.5.1. Méthode 32

4.5.2. Résultats de la comparaison intra-descendance 33

CHAPITRE 5. DISCUSSION 38

CHAPITRE 6. CONCLUSION 43

BIBLIOGRAPHIE 45

ANNEXES 48

ABREVIATIONS

°C : degré Celcius

µg : microgramme

µl : microlitre

ADN :Acide ésoxyriboNucléique

AFLP Amplified fragment length polymorphism

cm : centimétre

CTAB : hexadecyltrimethylammoniumbromide

DNase : DésoxyriboNucléase

dNTP:déoxyNucléotide TriPhosphate

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

mg : milligramme

MgCl2 : magnesium chloride

min : minute

ml : millilitre

mm : millimétre

mM : millimolaire

NaCl : chlorure de sodium

ng : nanogramme

pb : paire de base

PCR : Polymerase Chain Reaction

pmol : picomole

Taq polymérase :polymérases (Thermus aquaticus)

Tm : Température de fusion

Tris : hydroxymethyl

U/µl : unité par microlitre

Introduction

Les insectes font partie du groupe taxonomique le plus diversifié (May, 1990) et certains d’entre eux se sont dirigés vers un mode de vie phytophage. La plupart des phytophages sont des spécialistes locaux, c’est-à-dire des espèces exploitant une seule espèce de plante hôte dans une partie de leur aire de distribution mais également un ensemble d’espèces de plantes sur l’ensemble de leur aire (Fox et Morrow, 1981). La spécialisation locale de l’insecte à une plante hôte est un moteur de la structuration de population voire de l’isolement reproducteur entre les populations et peut-être une source de spéciation (Tauber et al., 1989 ; Rice, 1987).

La spéciation a été définie comme le phénomène d'apparition d'une nouvelle espèce à partir d'une espèce mère au sein d'un écosystème. Ce processus est continu dans le temps et l'existence de nombreuses espèces d'insectes encore non différenciées morphologiquement révéle cette différenciation graduelle. Plusieurs types de spéciation basés sur la répartition géographique des populations en cours de divergence existent. On parle ainsi: de spéciation allopatrique lorsque les populations sont séparées géographiquement ce qui provoque un arrêt des échanges génétiques et l'accumulation progressive de différences; - de spéciation parapatrique lorsque les populations entretiennent une zone de contact en raison d'un isolement reproducteur incomplet; - de spéciation sympatrique lorsque les populations occupent la même localisation.

L'isolement reproducteur est donc l'événement déterminant qui permet la formation d'une nouvelle espèce, ses mécanismes sont variés et peuvent correspondre à un isolement prézygotique ou précopulatoire en prévenant la formation des hybrides, ou à un isolement postzygotique ou postcopulatoire en réduisant la viabilité ou la fertilité des hybrides.

Les mécanismes prézygotiques qui mènent à l'isolement reproducteur ont des causes diverses. Ces causes peuvent être (1) écologiques résultant d'incompatibilités entre populations qui préfèrent des habitats différents dans une même aire géographique, (2) temporelles c'est-à-dire que la copulation ou la floraison est décalée dans le temps, (3) sexuelles, lorsqu'il y a peu ou pas d'attirance sexuelle entre populations en cours de divergence, (4) mécaniques ou gamétiques, lorsqu'il y a incompatibilité des structures génitales ou des gamètes (Dobzhansky 1937; Mayr 1942).

Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de spéciation sympatrique. En effet, les insectes phytophages fournissent des exemples majeurs qui confirment l'existence de ce mode de spéciation. On trouve notamment le cas de R. pomonella la mouche des pommes (Bush, 1969) ou le puceron du pois A. pisum (Via, 1999, Via et al., 2000).

Mayr (1974) définit la spéciation sympatrique comme l’origine des mécanismes d’isolement entre individus se produisant au sein même d’une population. Une espèce peut engendrer deux nouvelles espèces sans séparation géographique. Dans les populations naturelles, c’est le comportement des individus au sein d’une population qui va permettre la mise en place d’un isolement reproducteur sans barrière géographique (Bush, 1975) notamment la préférence pour un certain habitat (changements de plantes hôtes). Le comportement alimentaire de l'insecte phytophage et le choix des sites de ponte joue un rôle important (David, 1977). Les insectes vont s’accoupler préférentiellement dans l’habitat qui leur est favorable et accumuler des différences génétiques. Dans leur synthèse sur les races d'hôtes des insectes phytophages et leurs importance dans la spéciation sympatrique, Drés et Mallet (2002) désignent par race d’hôtes des populations d’insectes de la même espèce qui utilisent des plantes hôtes différentes et montrent une interruption partielle des flux de gènes notamment lors de l’exploitation de plantes hôtes en sympatrie.

Il est assez difficile de mettre en évidence la divergence génétique due au choix de l’hôte entre deux populations. Pour cela, nous devons estimer les flux de gènes entre les différentes populations. L’analyse de la structure génétique des populations va nous permettre d’estimer les variations génétiques et les flux géniques résultant des événements de migration, des processus de sélection, de mutation et de dérive. Cette analyse a été largement facilitée par le développement des marqueurs moléculaires neutres (Sunnucks, 2000) comme les marqueurs allozymiques ou les marqueurs microsatellites.

La plupart des charançons du genre Larinus (Coléoptère: Curculionidae) sont des espèces spécialistes (Briese et Sheppard, 1992, Briese et al., 1996) et représentent de bons modèles pour l’étude de la spéciation. Les charançons L. cynarae sont présents en particulier sur tout le pourtour du bassin Méditerranéen où ils parasitent différentes espèces de plantes hôtes selon les régions. Dans le Sud de la France, en Corse et au Nord de l’Espagne, L. cynarae s’attaque aux chardons du genre Onopordum alors qu’en Grèce, en Italie et au Sud de l’Espagne on le retrouve sur le genre Cynara. La Sardaigne offre une situation originale puisque L. cynarae exploite les deux espèces de plantes hôtes présentes. Cette situation est donc favorable à l’étude de l’évolution de populations de L. cynarae dont les différences de choix de plante hôte peuvent mener à un isolement reproducteur.

Cette étude porte sur les interactions entre le charançon Larinus cynarae et ses plantes hôtes. Cette approche est basée (1) sur l’analyse des taux d’attaques de charançons en populations naturelles de Sardaigne et de Corse (2) sur des expériences de choix d’hôtes effectuées en conditions contrôlées au laboratoire (3) sur la différenciation spatiale entre populations de charançons échantillonnés sur des plantes hôtes de la même espèce ou d’espèces différentes, à l’aide de marqueurs génétiques.

L’interprétation de la structure génétique des populations dépend de la neutralité des marqueurs génétiques et souvent la neutralité sélective des allozymes (seuls disponibles au début de notre étude) a été remise en cause (Pogson et al.,1995, Dufresne et al.,2002). Nous avons donc souhaité comparer la structure génétique des locus enzymatiques à celle obtenue à partir de locus considérés plus neutres et plus polymorphes tels que les microsatellites. Nous avons donc développé des marqueurs microsatellites sur Larinus cynarae.

Ces locus microsatellites et allozymiques nous ont permis de répondre à des questions relatives à l’association du charançon avec ses plantes hôtes et aux flux géniques entre individus des différentes populations de charançons. Pour cela, nous avons analysé des populations présentes sur des sites séparés par des distances géographiques variables, allant d’une dizaine de kilomètres à plus d’une centaine de kilomètres. Nous avons également analysé les charançons adultes dans des localités parfois très proches mais occupées par des plantes hôtes différentes ou dans des localités éloignées et occupées par les mêmes espèces de plantes, et enfin dans des populations sympatriques de plantes hôtes. Les résultats comparés de différenciation génétique et du choix de l’hôte nous ont permis d’évaluer les conséquences du choix sur la différenciation génétique entre les différentes populations de charançons sardes et corses.

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