Ministere de l'education nationale

 

ecole pratique des hautes etudes

Sciences de la Vie et de la Terre

 

 

années universitaires 1999-2001

 

 

 

présenté par

Samuel IGLESIAS

 

 

 

 

 

pour l'obtention du diplôme de l'ecole Pratique des Hautes Etudes

 

 

 

Systématique, phylogénie moléculaire, évolution et adaptation des Scyliorhinidae

*

Recherche de marqueurs moléculaires de Population chez deux Squaliformes d'intérêt commercial de l'Atlantique Nord-Est

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Soutenu le 28 Septembre 2001 devant le jury suivant:

 

Pr. GALZIN René                                                                            Président                                      EPHE, Perpignan

Dr. VAN WORMHOUDT                                                           Rapporteur                                   CNRS-EPHE, Concarneau

Dr. SELLOS Daniel                                                                         Examinateur                                CNRS, Concarneau

Dr. PLANES Serge                                                                          Examinateur                                CNRS, Perpignan

 

 

 

 

Laboratoire d'Evolution Moléculaire et Adaptation

EPHE, Station de Biologie Marine, BP 225, 29182 Concarneau cedex

(Section Sciences de la Vie et de la Terre; Département Milieux, Organismes et Evolution)

Directeur: Van Wormhoudt Alain (avw@mnhn.fr)

 

Station de Biologie Marine de Concarneau

MNHN, BP 225, 29182 Concarneau cedex

Directeur de stage: SELLOS Daniel (sellos@mnhn.fr)


Résumé

 

En 1997, huit espèces nominales (7 valides) de Scyliorhinidae étaient répertoriées en Atlantique Nord-Est. Récemment A. maderensis a été placé comme synonyme junior de A. laurussonii. Une nouvelle espèce, A. aphyodes, a été décrite et une autre, A. rugapelis, est en cours de description. Les capsules ovigères d'A. aphyodes et G. murinus ont été décrites pour la première fois. Le présent travail a permis également de confirmer la présence de A. manis et A. microps dans la zone. Le nombre d'espèces valides dans l'Atlantique Nord-Est est donc porté à neuf. L'étude suivante est basée sur la collecte de 563 spécimens, parmi lesquels 105 sont placés en collection. La distribution des spécimens collectés dans le passé et pour cette étude est présentée pour les espèces les moins communes. Des descriptions taxinomiques complémentaires sont données (description des capsules ovigères, des denticules dermiques, nombre de vertèbres, de valvules spirales et de dents). Une clé est proposée pour dix espèces, incluant l'espèce G. atlanticus présente dans le sud de la zone étudiée.

Avec 105 espèces valides, les Scyliorhinidae représentent plus du quart des 395 espèces de requins actuellement connues. Les genres étudiés ici sont représentatifs des différents niveaux bathymétriques colonisés par la famille. La réalisation d'une phylogénie moléculaire fondée sur le gène mitochondrial codant l'ARNr 16S, révèle la paraphylie des Scyliorhinidae. La distribution bathymétrique des espèces de ce nouveau groupe nommé ici "Scyliorhinidae" sensu lato est échelonnée depuis la zone intertidale jusqu'aux abysses et peut être corrélée avec le développement progressif de la longueur du museau. Celle-ci est liée à l'efficacité du sens électrique, permettant la détection des champs électriques et magnétiques. La diminution progressive de l'intensité lumineuse d'origine solaire avec la profondeur est une contrainte environnementale invariable, imposée aux organismes occulés. Sans en être la cause unique, cela peut néanmoins avoir conduit le processus évolutif dans un "champ des possibles". L'obscurité des grands fonds sous-marins a nécessité le développement d'un sens autre que la vue, à savoir, l'électroréception, pour l'orientation spatiale et la détection de proies non bioluminescentes. Par l'intermédiaire d'une phylogénie moléculaire nous montrons que l'élongation du museau est une innovation au sein des "Scyliorhinidae" sensu lato, le museau court étant un état de caractère primitif. Nous mettons en évidence un singulier exemple de processus évolutif, contraint et orienté par une force sélective supposée : la diminution de l'intensité lumineuse. Nous concluons à une origine côtière pour les "Scyliorhinidae" sensu lato et à un ancêtre commun avec un sensibilité électrique plus faible.

Deux squaliformes (Centroscymnus coelolepis et Centrophorus squamosus) sont exploités depuis une dizaine d'années sur des fonds de 800 à 1300 mètres par des chalutiers hauturiers français, à l'Ouest des Iles Britaniques. Ces espèces apparaissent particulièrement sensibles à l'exploitation et un modèle de gestion rationnel de la ressource doit rapidement être mis en place. Nous cherchons dans cette étude à définir des marqueurs moléculaires susceptibles de distinguer d'éventuelles populations au sein de chacune des 2 espèces. Un totale de 242 spécimens de C. coelolepis et 144 spécimens de C. squamosus ont été échantillonnés à bord de chalutiers semi-industriels. Dans une première approche, nous avons sélectionnés 32 fragments d'ADN susceptibles de contenir des séquences microsatellites. Douze séquences microsatellites ont été identifiées. La variabilité intra-spécifique a été testée pour les 3 séquences microsatellites les plus adaptées à une étude de population. La variabilité des ces séquences a été testée par comparaisons de profils de migration sur un premier lot de 20 spécimens de C. coelolepis provenant de deux secteurs géographiques distincts. Aucun polymorphisme de longueur n'a été observé pour ces séquences microsatellites. L'étude s'est alors orientée vers la définition de nouveaux types de marqueurs nucléaires (ITS-1) et mitochondriaux (D-loop) dont la variabilité de séquence sera testée par alignement des séquences nucléotidiques ou par comparaison de profils de restriction.


Table des matières de l'introduction

 

I - Première partie: Révision de la Systematique, des Scyliorhinidae de l'atlantique nord-est

 

II - Deuxième partie: phylogenie moleculaire, evolution et adaptation des scyliorhinidae

 

III - Troisième partie: Recherche de marqueurs moleculaires de Population chez deux Squaliformes d'interet commercial de l'Atlantique Nord-Est

III.1 - Présentation de la pêcherie

III.2 - Problématique

III.3 - Objectifs de l'étude

III.4 - Marqueurs moléculaires de population chez les requins


Introduction

 

La systématique est l'un des pilier de la biologie. Aucune des nombreuses disciplines qui composent la biologie ne saurait se passer de cette partie de la science qui nomme et organise le vivant. Toute étude biologique se doit de nommer le matériel qu'elle utilise, faisant ainsi nécessairement référence au rang taxinomique d'une classification. L'espèce, avec sa nomenclature binominale, est le rang taxinomique auquel la plupart des études font référence. Si la systématique de certains groupes zoologiques est maintenant bien définie, elle demeure à l'état de chantier pour d'autres groupes. Cette hétérogénéité dans l'avancement des classifications des groupes zoologiques s'explique notamment par la plus ou moins grande accessibilité des organismes. La petite taille de certains organismes, le milieu qu'ils habitent, leur mode de vie, la richesse spécifique de certains taxa sont autant d'éléments pouvant expliquer que certain groupes zoologiques sont encore mal connus. De par la difficulté des investigations en milieu marin (notamment le milieu profond), l'immensité des océans et leur extrême diversité spécifique, la systématique de nombreux groupes zoologiques marins reste en chantier. C'est le cas, par exemple des poissons osseux qui comptent pourtant déjà près de 25000 espèces. Les requins comptent quelque 395 espèces et de nouvelles espèces continuent d'être décrites, notamment dans les taxa vivant en milieu profond. Dans la première partie de ce travail, nous actualisons la systématique des Scyliorhinidae de l'Atlantique Nord-Est. Cette famille comprend notamment la petite roussette (Scyliorhinus canicula) qui est un modèle pour de nombreuses études biologiques. La famille comprend 9 représentants dans la zone géographique étudiée, la plupart en milieu profond. La systématique du groupe était jusqu'alors très confuse et incomplète (avec une espèce non décrite, des espèces synonymes, des espèces incertaines pour la zone, des descriptions d'espèces très peu documentées).

Souvent dénigrée à tort de par les moyens qu'elle utilise (anatomie comparative, mensurations...) la systématique connaît un renouveau depuis une dizaine d'années avec les progrès de la biologie moléculaire. L'obtention de séquences nucléotidiques et la comparaison de ces séquences vont permettre la construction de phylogénies fondées sur des critères moléculaires. L'utilisation de séquences nucléotidiques va permettre de travailler sur un nombre très important de caractères informatifs. Les caractères permettant l'analyse n'étant pas directement choisis par l'analyste, on évite ainsi l'influence du choix de tel caractère plutôt que de tel autre. La deuxième partie de cette étude établit les liens phylogénétiques existant au sein des Scyliorhinidae. Ceux-ci constituent la plus grande famille de requins avec 105 espèces actuellement reconnues. Cette famille typiquement benthique à la particularité d'avoir des représentants à tous les niveaux bathymétriques depuis la zone intertidale jusqu'à plus de 2000 mètres de fond. Comme tous les requins, les Scyliorhinidae ont un sens électro-sensoriel pour la détection des champs électriques. Nous montrons que les Scyliorhinidae ont un sens électrique d'autant plus développé que l'espèce vit plus profond. Dans cette partie, en utilisant une phylogénie moléculaire, nous faisons l'hypothèse du processus évolutif et des contraintes environnementales à l'origine du gradient de développement du sens électro-sensoriel observé chez cette famille.

Depuis la fin des années 80, suite aux diminutions des stocks par sur-pêche des espèces traditionnellement capturées sur le plateau continental, plusieurs pays européens dont la France, se sont orientés vers l'exploitation d'espèces vivant plus en profondeur, sur le talus continental et encore jamais exploitées. Afin d'observer et de gérer le développement de ces nouvelles pêcheries, la commission européenne a organisé en 1993 et 1994 des ateliers de travail. Par ailleurs, suite aux fortes baisses des stocks d'Elasmobranches observées au niveau mondial, du fait d'une exploitation intensive, l'Organisation des Nations Unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO) a élaboré en 1998 un plan d'action international pour une gestion durable de la ressource. Ce plan prévoit que les états signataires s'engagent à évaluer leurs stocks, à en assurer la surveillance et à publier des rapports sur l'évolution de leurs populations d'Elasmobranches, et ce pour les espèces cibles comme pour les espèces accessoires. La problématique abordée dans la troisième partie est indépendante de celle abordée dans les deux premières, même si l'on utilise ici des outils moléculaires déjà utilisés pour l'étude phylogénétique. Il s'agit d'une étude plus appliquée aux problèmes et besoins de la pêche pour pouvoir gérer de façon rationnelle une nouvelle ressource, on recherche ici des marqueurs moléculaires de population sur deux espèces de requins d'intérêt commercial (Centroscymnus coelolepis et Centrophorus squamosus) vivant par grande profondeur et ciblées par les nouvelles pêcheries européennes. Le but de l'étude étant de distinguer les limites du ou des stocks pour chacune de ces deux espèces, pour pouvoir ensuite en évaluer leur abondance.

Le mémoire suivant se compose de 3 parties indépendantes mais pouvant être regroupées en deux thématiques: les deux premières parties pouvant se regrouper dans la thématique "Systématique, phylogénie moléculaire, évolution et adaptation des Scyliorhinidae". La troisième partie traitant de la "Recherche de marqueurs moléculaires de Population chez deux Squaliformes d'intérêt commercial de l'Atlantique Nord-Est." De par l'unité de chacune des trois parties, il a été choisi de rédiger un résumé, une introduction présentant la problématique et les objectifs, le matériel et méthodes, les résultats et la conclusion pour chacune des parties. La problématique des deux premières parties ayant été menée à terme, il a été choisi de présenter les résultats sous forme de manuscrit de publication.

 

 

I - Première partie: Révision de la Systematique, des Scyliorhinidae de l'atlantique nord-est

 

La connaissance des Scyliorhinidae vivant en milieu profond (principalement le genre Apristurus) a beaucoup progressé ces dernières années, notamment grâce aux récentes explorations scientifiques profondes menées dans des zones géographiques inexplorées, ainsi que grâce au développement récent de pêcheries professionnelles profondes s'effectuant entre 1000 et 2000 mètres. Plusieurs nouvelles espèces ont ainsi été décrites ces dernières années: Apristurus albisoma (Nakaya & Séret, 1999), A. exsanguis (Sato et al., 1999) et A. aphyodes (Nakaya & Stehmann, 1998). Au moins cinq espèces sont en cours de description en Nouvelle-Calédonie et Nouvelle-Zélande (Nakaya & Séret, com. pers.). Les connaissances sur la systématique de la famille a également largement progressé ces dernières années dans des secteurs géographiques pourtant largement prospectés comme l'Atlantique Nord-Est.

Le présent travail se propose de réviser et d'enrichir les connaissances sur la systématique des Scyliorhinidae de l'Atlantique Nord-Est. Les résultats sont présentés sous forme d'un manuscrit encore en cours de rédaction et qui devrait être soumis à la revue Cybium.

 

 

II - Deuxième partie: phylogenie moleculaire, evolution et adaptation des scyliorhinidae

 

La classification du vivant fondée sur l'apparentement évolutif entre espèces se présente sous la forme de phylogénies. La méthode d'analyse cladistique (ou systématique phylogénétique) dont l'utilisation est maintenant généralisée en classification du vivant connaît un renouveau avec le progrès des techniques de biologie moléculaire depuis une dizaine d'années (Lecointre & Le Guyader, 2001). La multiplicité des caractères apportés par la comparaison des séquences nucléotidiques permet de construire des phylogénies soutenues par de nombreux caractères informatifs. Les séquences nucléotidiques permettent en outre d'établir les liens de parentés entre des organismes éloignés en termes d'évolution pour lesquels les critères morphologiques et anatomiques utilisés ne sont pas forcément homologues et donc pas comparables entre eux.

Les études traitant des relations phylogénétiques au sein des Elasmobranches inférées à partir de la comparaison de séquences d'ADN sont peu nombreuses. Ainsi, seules 33 des environ 395 espèces de requins actuellement reconnues sont traitées dans ces études, la plupart appartenant aux grandes espèces pélagiques des familles Carcharhinidae, Lamnidae et Sphyrnidae. Les relations intra-familiales n'ont été inférées que pour ces trois familles. Toutes les études de phylogénie moléculaire portant sur les requins ont utilisées des séquences nucléotidiques du génome mitochondrial. Les séquences utilisées pour ces études sont les gènes codant l'ARNr 12S, le Cytochrome b, le Cytochrome oxydase I et la NADH-2.

Martin et al. (1992) établissent les relations phylogénétiques entre 12 espèces de requins appartenant aux ordres des Lamniformes (6 espèces) et des Carcharhiniformes (6 espèces), à partir de l'alignement de 855 à 1551 pb des gènes mitochondriaux codant le Cytochrome b et le Cytochrome oxydase I. Ils calibrent également un taux d'évolution du génome mitochondrial pour les requins. Martin (1993) réalise la phylogénie moléculaire de 10 espèces de Sphyrnidae (requins marteaux) en alignant 921 pb de 2 gènes mitochondriaux. Dunn et al. (1995) réalisent la phylogénie moléculaire de 5 espèces d'Elasmobranches appartenant à 5 ordres différents en alignant 303 pb du gène mitochondrial codant l'ARNr 12S. Martin (1995) établit les relations phylogénétiques entre 14 espèces appartenant aux Carcharhinidae et aux Lamnidae à partir du Cytochrome b. Kitamura et al. (1996) établissent les liens phylogénétiques entre 8 espèces d'Elasmobranches en alignant 732 positions du Cytochrome b. Enfin, Naylor et al. (1997) établissent la phylogénie de 14 espèces de Lamniformes à partir des gènes mitochondriaux codant la NADH-2 et le Cytochrome b. Seule une étude (Martin, 1993) a exploitée ces données pour retrouver l'état d'origine d'une innovation biologique représentée ici par l'expansion latérale de la tête des requins marteaux, mais la nature des forces sélectives à l'origine de cette innovation n'est pas démontrée.

Les requins sont répartis en 8 ordres (Squatiniformes, Pristiophoriformes, Squaliformes, Hexanchiformes, Carcharhiniformes, Lamniformes, Orectolobiformes et Heterodontiformes). L'ordre des Carcharhiniformes comprend 8 familles (Scyliorhinidae, Proscyllidae, Pseudotriakidae, Leptochariidae, Triakidae, Hemigaleidae, Carcharhinidae, Sphyrnidae). Les Scyliorhinidae se composent de 15 genres dont les genres Scyliorhinus, Galeus et Apristurus sont les plus riches spécifiquement.

La famille des Scyliorhinidae a colonisé tous les types de milieux marins benthiques, elle comprend des représentants à tous les niveaux bathymétriques depuis la côte jusqu'à des profondeurs supérieures à 2000 mètres. Cette distribution bathymétrique peut être corrélée avec le développement en longueur du museau au sein de cette famille. Le museau chez les requins est le support de l'organe électrosensoriel composé d'ampoules de Lorenzini (Bleckmann et al., 1999) et permet la détection de champs électriques et magnétiques (Kalmijn, 1982). En utilisant une phylogénie moléculaire, nous cherchons à savoir si l'allongement du museau avec la profondeur est dû ou non à une sélection directionnelle. L'utilisation d'un arbre phylogénétique enraciné va permettre de polariser les différents états de caractères observés. Nous chercherons enfin la nature des forces sélectives et plus particulièrement les contraintes environnementales pouvant avoir orienté l'évolution.

La mise en évidence des relations inter-familiales par une approche moléculaire est peu abordée chez les requins. Classiquement, dans la littérature, les familles des Triakidae et des Pseudotriakidae sont placées comme groupes frères des Scyliorhinidae. L'intégration de représentants de ces 2 familles dans la construction phylogénétique permettra de préciser les liens de parenté unissant ces trois familles. Récemment, Nakaya et al. (1999) ont distingué 3 groupes au sein du genre Apristurus sans leur donner de rang taxinomique et ce, en attendant que leurs relations phylogénétiques soient mieux clarifiées. Le genre Apristurus est à l'heure actuelle le plus grand genre de requins et probablement le plus mal connu. L'examen de la topologie de l'arbre phylogénétique obtenu à partir de données moléculaires incluant 7 espèces du genre appartenant à 2 des 3 groupes définis par Nakaya et al. (1997) permettra de confirmer ou non la validité phylogénétique de ces groupes et d'établir les liens de parenté au sein même des groupes.

 

 

III - Troisième partie: Recherche de marqueurs moleculaires de Population chez deux Squaliformes d'interet commercial de l'Atlantique Nord-Est

 

III.1 - Présentation de la pêcherie

 

Deux espèces de squaliformes (Centrophorus squamosus et Centroscymnus coelolepis) vivent dans les eaux profondes de l'Atlantique Nord en-dessous de 600 m. Les zones exploitées sont réparties le long du talus continental depuis le Portugal jusqu'au sud de l'Islande et sur les bancs isolés (Rockall, Hatton, Lousy). Ces deux espèces intéressent directement les chalutiers hauturiers de Boulogne, Concarneau et Lorient. Ces espèces sont exploitées depuis une dizaine d'années en France et les tonnages débarqués atteignent 3000 à 3500 tonnes par an pour une valeur de l'ordre de 31860 KF (en 1998). Les études en cours à la Station de Biologie Marine de Concarneau sont focalisées sur la répartition le long du talus continental à l'Ouest des Iles Britanniques, et sur la reproduction : démographie, taille de première maturité sexuelle et cycle de fécondité. (Girard, 2000; Girard & al. 1999). Un aménagement de cette pêcherie doit être rapidement organisé car les espèces apparaissent particulièrement vulnérables à l'exploitation (espèces vivipares à fécondité très faible, 12 à 15 petits par portée, croissance lente).

 

 

III.2 - Problématique

 

Les observations ont montrées qu'une grande partie de la population échappe aux engins de capture, les jeunes de la naissance jusqu'à 70-75 cm de LT, probablement une fraction des femelles adultes et les femelles gestantes de C. squamosus. Une première hypothèse a été proposée pour expliquer ces trous dans la distribution : les deux espèces migrent dans le Nord-Est Atlantique, entre la dorsale et l'Europe ; tous les stades ne seraient pas représentés sur le talus continental européen. Une autre hypothèse est favorable à une migration sur place des individus, dans la colonne d'eau, décollés du fond, inaccessibles aux engins démersaux et donc de l'existence de populations locales plus ou moins isolées (Girard, 2000). L'aire de distribution des espèces se présente le plus souvent selon deux modèles : a) une aire continue sur une vaste zone géographique. b) plusieurs aires discontinues, isolées les unes des autres. Dans le premier cas il convient de déterminer s'il existe une seule population ou plusieurs populations distinctes juxtaposées. Si ces agrégations correspondent à des unités de stocks complètement indépendantes ou si les juvéniles (ou recrues) proviennent de la même aire de ponte.

 

 

III.3 - Objectifs de l'étude

 

L'identification génétique des requins récoltés dans différentes zones de l'Atlantique Nord apporterait des arguments en faveur de l'une ou l'autre des hypothèses de distribution des espèces. Cette identification génétique sera réalisée soit par l'étude de fragments polymorphes amplifiés au hasard (RAPD) soit par l'analyse de profils d'amplification de fragments spécifiques: de l'ADN mitochondrial (gène de l'ARN 16S, D-loop) et du génome nucléaire (mini ou microsatellites, ITS-1) ; le premier objectif sera de choisir quels sont les meilleurs marqueurs de population pour pouvoir ensuite déterminer la limite du ou des stocks et enfin pouvoir évaluer leur abondance.

 

 

III.4 - Marqueurs moléculaires de population chez les requins

 

De nombreux articles traitent de l'identification de populations de téléostéens à l'aide de marqueurs moléculaires, notons par exemple les travaux de DeWoody & al. (2000) et Iyengar & al. (2000) sur des microsatellites ; ceux de Booton & al. (1999) sur des ITS-1 ; ceux de Grant & al. (1998) avec des profils RFLP ; ceux de Smith & al. (1997) par RAPD ou enfin ceux de Ludwig & al (1998), Richardson & al. (1997), Turan & al. (1998) et Wirgin et al. (1997) sur de l'ADNmt. Par contre les études de population restent peu nombreuses chez les Chondrichthyens. L'identification de populations de requins par comparaison du polymorphisme de longueur des fragments de restriction obtenus par digestion de séquences de l'ADN mitochondrial par des enzymes de restrictions (RFLP) reste la technique la plus utilisée (Heist et al., 1996a, 1996b; Gadner et al. 1998). Cette même technique a également été utilisée pour l'identification d'espèces de requins (Martin, 1991 ; Heist et al., 1999). Enfin, seule deux études ont utilisé des microsatellites comme marqueurs de population chez des requins (Heist et al., 1999 ; Pardini et al., 2000) et aucune étude de population n'a portée sur des marqueurs microsatellites.


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